“Validasi metode analisis senyawa cefotaxime dengan Standar internal cefadroxil secara kromatografi cair Kinerja tinggi”

BAB I

PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang

Cefotaxime adalah antibiotic golongan sefalosporin generasi ketiga yang mempunyai khasiat bakterisidal dan bekerja dengan menghambat sintesis mukopeptida pada dinding sel bakteri. Cefotaxime sangat stabil terhadap hidrolisis beta laktamease, maka Cefotaxime digunakan sebagai alternatif lini pertama pada bakteri yang resisten terhadap Penisilin. Cefotaxime memiliki aktivitas spectrum yang lebih luas terhadap organisme gram positif dan gram negatif. Aktivitas Cefotaxime lebih besar terhadap bakteri gram negatif sedangkan aktivitas terhadap bakteri gram positif lebih kecil, tetapi beberapa streptococci sangat sensitif terhadap Cefotaxime.

Cefadroxil adalah antibiotika semisintetik golongan sefalosforin untuk pemakaian oral. Golongan sefalosforin secara kimiawi memiliki mekanisme kerja dan toksisitas yang serupa dengan penicillin. Sefalosforin lebih stabil daripada penicillin terhadap banyak bacteria beta-laktamase sehingga biasanya mempunyai spektrum aktivitas yang lebih luas. Cefadroxil bersifat bakterisid dengan jalan menghambat sintesa dinding sel bakteri.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography) adalah bagian dari teknik pemisahan senyawa dengan menggunakan fase gerak cair. Salah satu bentuk aplikasi dari kromatografi cair adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menurut polar atau tidak polarnya fasa diam dibagi menjadi dua yaitu KCKT fase normal yaitu dengan menggunakan fase diam polar dan fase gerak nonpolar dan KCKT fase terbalik yaitu dengan menggunakan fase diam non polar dan fase gerak polar.

B.     Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari makalah ini yaitu apakah metode analisis dengan standar internal Cefadroxil secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dapat digunakan untuk menganalisis senyawa Cefotaxime?

C.    Tujuan

Tujuan dari makalah ini adalah untuk mengetahui apakah metode analisis dengan standar internal Cefadroxil secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dapat digunakan untuk menganalisis senyawa Cefotaxime.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Cefotaxime adalah antibiotik golongan sefalosporin generasi ketiga yang mempunyai khasiat bakterisidal dan bekerja dengan menghambat sintesis mukopeptida pada dinding sel bakteri. Cefotaxime sangat stabil terhadap hidrolisis beta laktamase, maka cefotaxime digunakan sebagai alternatif lini pertama pada bakteri yang resisten terhadap penisilin. Pada pengobatan dengan cefotaxime, bila pasien memiliki volume distribusi sangat kecil, sebagian besar obat ada didalam darah. Antibiotik cefotaxime ini dapat diberikan secara i.v. dan i.m. karena absorpsi di saluran cerna kecil. Masa paruh eliminasi pendek sekitar 1 jam, maka diberikan tiap 12 jam MIC dapat dicapai dalam waktu 10 jam. Ikatan protein plasma sebesar 40 % (Prabaningrum dan Septiana, 2008).

Cefotaxime adalah antibiotik baru yang hingga saat ini belum ada metode análisis    yang tervalidasi yang dapat dijadikan acuan untuk menetapkan  kadar antibiotik tersebut. Untuk penetapan kadar cefotaxime, dilakukan analisis obat dalam      pelarutnya. Sebelum dilakukan metode analisis, terlebih dahulu dilakukan validasi. Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan yang dilakukan sebagai pembuktian terhadap parameter-parameter tertentu yang   dipersyaratkan dan ditetapkan sehingga analisis yang dilakukan mendapatkan hasil yang diinginkan.

Suatu metode analisis baru dapat digunakan apabila telah dilakukan validasi. Hal ini karena adanya perbedaan alat, keterbatasan alat, bahan kimia atau kondisi lain yang menyebabkan metode tersebut tidak dapat diterapkan secara keseluruhan. Sehingga sering dilakukan modifikasi, penyederhanaan maupun perbaikan metode, akibatnya metode tersebut harus divalidasi dengan cara yang benar. Apabila metode  ini dapat dipertanggungjawabkan secara keseluruhan (presisi, akurasi, selektivitas, batas  deteksi,  batas  kuantitasi,  stabilitas dan lain-lain), tidak menyimpang, dan diakui oleh pihak yang berkompeten, maka  metode  yang dimodifikasi ini dianggap valid dan dapat digunakan untuk analisis rutin (Hidayat, 1999).

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengembangan penetapan kadar cefotaxime dalam sediaan farmasi telah dilakukan dengan menggunakan metode KCKT dengan detector UV dalam cairan cerebrospinal. Namun demikian, selama ini belum pernah dilaporkan penelitian mengenai validasi metode penetapan cefotaxime dalam pelarut menggunakan KCKT dengan detektor UV.

VALIDASI METODE 

Metode validasi yang digunakan dapat ditentukan dari beberapa faktor. Dalam penelitian ini dilakukan parameter-parameter yang meliputi, selektivitas, Keterulangan (Repeatability), Pembuatan Kurva Baku, Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ), Akurasi dan Presisi dan Uji Kesesuaian Sistem (System Suitability). 

1.      Selektivitas 

Dengan melihat kromatogram cefotaxime dan cefadroxil hasil pemisahan secara KCKT, tidak adanya puncak yang saling tumpang tindih, walaupun kedua zat dalam satu turunan. Selektivitas dinyatakan dengan nilai resolusi atau daya pisah (R) dan nilainya > 1,5

2.      Keterulangan (Repeatability)

Dibuat konsentrasi larutan Cefotaxime 10 µg/ml dalam fasa gerak, kemudian disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam alat KCKT pada kondisi optimum. Percobaan diulang sebanyak enam kali, kemudian dihitung koefisien variasinya (%KV).

3.      Pembuatan Kurva Baku

Lima seri konsentrasi Cefotaxime 5, 10, 15, 20 dan 25 µg/ml dengan standar internal Cefadroxil konsentrasi 5 µg/ml dalam fasa gerak (pada setiap konsentrasi Cefotaxime) disiapkan dengan membuat pengenceran secara seri dari stok larutan baku Cefotaxime dengan fasa gerak. Selanjutnya sejumlah 10 µl disuntikkan ke dalam alat KCKT pada kondisi optimum. Penentuan linieritas dilakukan tiga kali pengulangan. Kurva kalibrasi yang diperoleh digunakan untuk menetapkan kadar sampel. Persamaan garis regresi linier digambarkan sebagai hubungan antara konsentrasi Cefotaxime dari rasio luas area kromatogram atau tinggi puncak kromatogram Cefotaxime terhadap standar internal Cefadroxil, kemudian dihitung koefisien korelasinya.

4.      Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Nilai batas deteksi dan batas kuantitasi analisis Cefotaxime dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi, nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = bx + a

Limit of detection (LOD) dinyatakan dengan :

                           LOD

Limit of quantitation (LOQ) dihitung dengan persamaan :

                                      

atau dinyatakan lain sebagai rasio signal terhadap noise dengan perbandingan (10 : 1) atau secara matematis dinyatakan dengan persamaan :

Y = Yb + 10 S

5.      Akurasi dan presisi

Akurasi dan presisi diperoleh dengan cara menetapkan kadar tiga sampel masing-masing tiga kali pengulangan (n = 3). Konsentrasi sampel dibuat sekitar kurva baku meliputi 3 10 µg/ml, 20 µg/ml dan 25 µg/ml. Kurva kalibrasi dengan koefisien korelasi terbaik digunakan untuk menetapkan Cefotaxime dalam sampel. Persen akurasi diperoleh dengan cara melihat kedekatan hasil dari sampel terhadap nilai nominal dan presisi dilihat dari nilai KV (%),

Presisi dinyatakan dengan KV (%), dengan persamaan :

Keterangan :      KV = Koefisien variasi, SD = Standar deviasi,  X= Rata-rata.

6.      Uji  Kesesuaian Sistem (System Suitability)

Uji kesesuaian sistem dilakukan terhadap sampel Cefotaxime konsentrasi 10 µg/ml dengan standar internal Cefadroxil 5 µg/ml dalam fasa gerak, kemudian disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam alat KCKT pada kondisi optimum.

Percobaan diulang sebanyak enam kali (n= 6). Dari kromatogram yang diperoleh ditentukan keterulangan penyuntikan larutan baku yang dinyatakan dengan KV dari waktu retensi, rasio luas area dan rasio tinggi puncak, tailing faktor dan asimetri puncak kromatogram.

·         Hasil Pengukuran Spektrofotometer Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Pada penetapan panjang gelombang larutan cefotaxime dalam pelarut diperoleh serapan maksimum pada panjang gelombang 235 nm dan untuk larutan cefadroxil diperoleh serapan maksimum pada 232 nm. Karena cefotaxime merupakan senyawa yang akan dianalisis, maka panjang gelombang maksimum cefotaxime ditetapkan sebagai panjang gelombang yang digunakan pada pendeteksian hasil analisis dengan KCKT.

·         Hasil Penentuan Nilai Ekstingsi Molar Cefotaxime

Penetapan nilai ekstingsi molar Cefotaxime dilakukan dari tiga variasi konsentrasi, yaitu 14,66, 20,95, dan  27,23 µM dalam fase gerak pada panjang gelombang maksimum cefotaxime, yakni 235 nm. Nilai ekstingsi molar cefotaxime dihitung dengan membandingkan nilai serapan atau absortivitas molar cefotaxime terhadap tebal kuvet (umumnya 1 cm) dan konsentrasi cefotaxime yang diukur.

Hasilnya menunjukkan nilai ekstingsi molar cefotaxime rata-rata 79.991, 86 M^-1 cm^-1. Nilai ini menunjukkan bahwa cefotaxime sangat memungkinkan untuk dideteksi dengan jdetektor ultraviolet pada sistem KCKT. Hal ini disebabkan karena adanya gugus kromofor (ikatan rangkap terkonjugasi) pada struktur cefotaxime.

·         Hasil Uji Selektivitas

Untuk mengetahui selektivitas suatu metode yang digunakan, dapat dilihat

dari daya keterpisahan (resolusi) kedua puncak. Pada Gambar 4.2 terlihat puncak cefadoxil dengan waktu retensi 4,400 menit terpisah dari puncak cefotaxime dengan waktu retensi 10,933 menit dengan nilai resolusi R = 2,72, sesuai persyaratan untuk nilai resolusi yaitu > 1,5. Dengan nilai resolusi tersebut, dapat disimpulkan bahwa metode KCKT ini dapat digunakan untuk menganalisis cefotaxime dengan menggunakan standar internal cefadroxil.

Gambar 4.2  Kromatogram cefotaxime dan standar internal cefadroxil

·         Hasil Uji Keterulangan (Repeatability)

Uji keterulangan dilakukan terhadap cefotaxime dengan konsentrasi 10 µg/ml menggunakan standar internal cefadroxil 5 µg/ml. Dilakukan replikasi sebanyak enam kali, kemudian diamati waktu retensi, luas area kromatogram, dan tinggi puncak kromatogram. Rata-rata waktu retensi untuk cefotaxime menunjukkan nilai 9,443 ± 0,08 menit dan KV = 0,85%.

·         Hasil Uji Linieritas

Uji linieritas dilakukan untuk melihat kemampuan metode analisis dalam memberikan respon yang baik pada berbagai macam konsentrasi analit pada suatu kurva kalibrasi untuk menghasilkan garis lurus. Parameter adanya hubungan linier dinyatakan dengan koefisien korelasi, dan suatu metode analisi yang valid mempunyai harga koefisien korelasi lebih dari 0,999 (L.R. Snyder et al., 1997).

Untuk mengetahui hubungan linieritas antara konsentrasi cefotaxime dengan rasio luas area kromatogram dan rasio tinggi puncak kromatogram, dibuat kurva kalibrasi dari cefotaxime. Kurva kalibrasi dibuat dengan cara membuat larutan cefotaxime dalam fasa gerak sehingga diperoleh konsentrasi akhir 5, 10, 15, 20, dan 25 µg/ml yang mengandung standar internal cefadroxil dengan konsentrasi akhir 5 µg/ml kemudian setiap konsentrasi cefotaxime diukur dengan KCKT. Masing-masing konsentrasi dilakukan tiga kali pengukuran. Persamaan garis regresi linier dengan koefisien korelasi terbaik digunakan untuk menetapkan kadar sampel cefotaxime untuk kemudian diamati nilai akurasi dan presisinya.

Nilai koefisien korelasi yang diperoleh berdasarkan rasio luas area kromatogram dan rasio tinggi puncak kromatogram menunjukkan nilai > 0,999, hal ini membuktikan bahwa metode analisis yang digunakan sudah memenuhi kriteria linieritas pada rentang 5-25 µg/ml.

·         Hasil Uji Limit of Detection (LOD)

Limit of detection (LOD) mutlak ditentukan jika analit yang dianalisis konsentrasinya relatif kecil seperti dalam matrik biologis (G. Indrayanto, 1994). Hasil uji LOD dihitung berdasarkan kurva kalibrasi cefotaxime dari persamaan yang mempunyai koefisien korelasi (r) terbaik. Nilai LOD ditetapkan dari kurva kalibrasi cefotaxime terhadap rasio luas area           kromatogram dan rasio tinggi puncak kromatogram. Nilai LOD dari rasio luas area kromatogram adalah 0,05082 µg/ml dan berdasarkan rasio tinggi puncak kromatogram adalah 0,05896 µg/ml.

·         Hasil Uji Limit of Quantitation (LOQ)

Limit of quantitation (LOQ) mutlak ditentukan jika analit yang dianalisis konsentrasinya relatif kecil seperti dalam matrik biologis (G. Indrayanto, 1994). Hasil uji LOQ dihitung berdasarkan kurva kalibrasi cefotaxime dari persamaan yang mempunyai koefisien korelasi (r) yang paling baik. Nilai LOQ ditetapkan dari kurva kalibrasi cefotaxime terhadap rasio luas area kromatogram dan rasio tinggi puncak kromatogram. Nilai LOQ dari rasio luas area kromatogram adalah 0,1694 µg/ml dan berdasarkan rasio tinggi puncak kromatogram adalah 0,1965 µg/ml. Nilai LOQ sangat tergantung pada galat sistemik yang dapat dilihat sebagai intercept atau titik potong pada sumbu y dari persamaan garis kurva kalibrasi.

·         Hasil Penentuan Ketelitian (Precision) dan Ketepatan (Accuracy)

Untuk mengetahui presisi dan akurasi, dibuat 3 macam konsentrasi sampel cefotaxime yang kadarnya ditetapkan berdasarkan kurva kalibrasi cefotaxime. Konsentrasi sampel cefotaxime dalam fasa gerak dibuat sekitar nilai kosentrasi pada kurva kalibrasi, berturut-turut adalah 10, 20, dan 25 µg/ml dan mengandung standar internal cefadroxil 5 µg/ml. Kadar sampel ditetapkan dari persamaan kurva kalibrasi cefotaxime terhadap rasio luas area kromatogram dan tinggi puncak. Kemudian data yang diperoleh digunakan untuk menentukan nilai akurasi dan presisi.

Perhitungan kadar sampel cefotaxime berdasarkan rasio luas area  romatogram memberikan nilai presisi yang dinyatakan sebagai KV (%) dari konsentrasi 10, 20, dan 25 µg/ml berturut-turut adalah 1,28%, 1,03%, dan 0,33%.. Nilai tersebut sesuai dengan persyaratan, yaitu dengan nilai KV < 2%. Untuk nilai akurasi yang dinyatakan dalam % recovery sampel dengan konsentrasi 10, 20, dan 25 µg/ml berturut-turut adalah 95,62-99,18%,  98,92100,84%, dan 99,66-100,32%

(perhitungan dapat dilihat pada Lampiran).

            Perhitungan kadar sampel cefotaxime berdasarkan rasio tinggi puncak kromatogram memberikan nilai presisi (KV %) untuk ketiga sampel berturut-turut adalah 0,19 %, 0,49% dan 0,35%. Untuk nilai akurasi dari sampel cefotaxime dengan konsentrasi 10, 20, dan 25 µg/ml dengan standar internal cefadroxil 5 µg/ml berdasarkan perhitungan kurva kalibrasi rasio tinggi puncak komatogram berturut-turut adalah 93,76-99,69%, 101,06-101,99%, dan 98,88-99,56% (perhitungan dapat dilihat pada Lampiran).

·         Hasil Uji Kesesuaian Sistem (System Suitability Test)

Untuk memastikan bahwa sistem yang digunakan berjalan secara efektif maka perlu dilakukan uji kesesuaian sistem. Suatu parameter yang berguna adalah keterulangan penyuntikan yang ditentukan dengan menghitung koefisien variasi (KV) dari waktu retensi, rasio luas area, rasio tinggi puncak, tailing factor, dan asimetri puncak kromatogram.

Dilakukan enam kali penyuntikan terhadap sampel cefotaxime dengan konsentrasi 10 µg/ml, yang mengandung standar internal cefadroxil 5 µg/ml, kemudian diamati waktu retensi, rasio luas area, dan rasio tinggi puncak kromatogram. Konsentrasi tersebut dipilih untuk mewakili konsentrasi rendah, diasumsikan jika hasil konsentrasi rendah sudah dapat memberikan nilai yang baik, maka diharapkan konsentrasi tinggi memberikan nilai yang baik pula. Pada Tabel 4.10 dapat diketahui KV dari waktu retensi, rasio luas area kromatogram, dan rasio tinggi puncak kromatogram < 4%, nilai ini menunjukkan bahwa metode analisis yang digunakan telah memenuhi kriteria kesesuaian sistem yaitu KV < 10%. 

Kesesuaian sistem juga digunakan untuk mengetahui faktor asimetri dan faktor ikutan (tailing factor) dari puncak. Asimetri dan faktor ikutan digunakan untuk mengetahui kondisi kolom dan kondisi percobaan. Asimetri puncak cefotaxime dengan konsentrasi10 µg/ml dan cefadroxil adalah 0 (terdapat pada hasil kromatogram), dapat dilihat pada kromatogram kesesuaian sistem (pada lampiran G) bahwa kedua puncak terlihat cukup simetris. Nilai tersebut telah memenuhi kriteria nilai asimetri yakni < 2 (L.R. Snyder et al., 1997). Nilai faktor ikutan untuk puncak cefotaxime dan cefadroxil adalah 0 (terdapat pada hasil kromatogram), dapat dilihat pada kromatogram keseuaian system (pada lampiran G) bahwa kedua puncak tidak memiliki factor ikutan. Faktor ikutan yang diperoleh telah memenuhi nilai persyaratan, yaitu < 2.

BAB IV

KESIMPULAN DAN SARAN

            Adapun kesimpulan dan saran dari makalah ini adalah sebagai berikut :

(1)   Optimasi kondisi KCKT dapat dilakukan dengan baik karena telah memenuhi kriteria dari waktu retensi, resolusi, jumlah keeping teoritis dan HETP, sehingga analisis lanjut dapat dilakukan secara KCKT dengan detektor UV.

(2)  Dari hasil validasi metode yang meliputi parameter : selektivitas, keterulangan, linieritas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketelitian, ketepatan, dan kesesuaian  sistem, maka metode yang digunakan memiliki validitas sesuai dengan yang dipersyaratkan sehingga dapat digunakan untuk menganalisis Cefotaxime dalam pelarutnya.

DAFTAR PUSTAKA

Maulana, Rijal Syahril, Dkk. 2009. Validasi metode analisis senyawa cefotaxime dengan Standar internal cefadroxil secara kromatografi cair Kinerja tinggi. Farmaka, Volume 7 Nomor 2, Universitas Padjadjaran, Jatinangor.