BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Perkembangan ilmu pengetahuan sejalan dengan perkembangan tekhnologi. Berbagai alat dengan kecanggihan semakin meningkat. Hal ini juga termasuk perkembangan dalam ilmu farmasi, tidak terkecuali bidang Analisis farmasi. Dalam bidang ini, selama beberapa tahun terakhir terjadi perkembangan yang pesat untuk teknik pemisahan. Penerapan metode seperti kromatografi dianggap metode modern yang saat ini sering digunakan dalam berbagai riset dan penelitian. Hal ini terbukti dengan banyaknya publikasi ilmiah yang berkaitan dengan penggunaan metode tersebut, baik untuk tujuan analisis kualitatif maupun kuantitatif.

Kromatografi banyak dipilih karena merupakan metode pemisahan yang sederhana. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa.Satu fasa tetap tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Kromatografi juga dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah, kompleksitas campuran yang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang sulit dipisah (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesis (Sastrohamidjojo, 1985). Namun dalam makalah ini hanya akan dibahas mengenai teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas maka rumusan masalah dalam makalah ini yaitu :

1. Apa yang dimaksud Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

2. Apa kelebihan dan kekurangan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

3. Bagaimana prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

4. Apa fase diam dan fase gerak yang sering digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

5. Bagaimana prosedur kerja pemisahan sampel dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

6. Bagaimana cara deteksi bercak dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT)?

7. Bagaimana penggunaaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk analisis obat-obatan?

C. Tujuan

Tujuan makalah ini yaitu :

1. Untuk mengetahui definisi Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

2. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

3. Untuk mengetahui prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

4. Untuk mengetahui fase diam dan fase gerak yang sering digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

5. Untuk mengetahui prosedur kerja pemisahan sampel dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

6. Untuk mengetahui cara deteksi bercak dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

7. Untuk mengetahui cara penggunaaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dalam analisis obat-obatan?

BAB II

PEMBAHASAN

A. Definisi KLT

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pertama kali dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik (Gandjar dan Rohman, 2007).

KLT merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Hostettmann et al, 1995).

Pada proses adsorpsi senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda.

Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita, setelah pelat/lapisan ditaruh dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan dengan menggunakan sinar UV (Sudjadi, 1988).

B. Kelebihan dan Kekurangan KLT

Beberapa kelebihan KLT yaitu:

1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.

2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.

4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.

7. Jumlah perlengkapan sedikit.

8. Preparasi sample yang mudah

9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adapun kekurangan KLT yaitu:

1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang diharapkan.

2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.

3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun

C. Prinsip Kerja KLT

Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang (Watson, 2010). KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas.

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

Gambar 1. Kesetimbangan yang terjadi pada KLT

D. Fase Diam dan Fase Gerak

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm (Gandjar dan Rohman, 2007). Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Silika gel salah satu contoh fase diam yang terbentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.

Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Gambar 2. Struktur Silika

Permukaan silika gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada dasarnya sifat serta penggunaannya mirip silika gel.

Tabel 1. Fase diam yang sering digunakan pada KLT (Kealey dan Haines, 2002)

Fasa Diam	Mekanisme Sorpsi	Penggunaan
Silika gel	Adsorpsi	Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid
Serbuk selulosa	Partisi	Asam amino, nukleotida, karbohidrat
Selulosa penukar ion	Pertukaran ion	Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion logam
Gel sephadex	Eksklusi	Polimer, protein, kompleks logam
Β-siklodekstrin	Interaksi adsorpsi stereospesifik	Campuran enansiomer

Selain fasa diam, dalam KLT juga diperlukan fasa gerak/eluent yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like” (Watson, 2010).

E. Prosedur Kerja dengan KLT

Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel ditempatkan di atasnya. Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis pada fasa diam berguna untuk menunjukkan posisi asli sampel. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fasa gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.

Gambar 3. Rangkaian Alat KLT

Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.

Gambar 4. Bercak Senyawa Organik

Diagram menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak sekitar setengah jalan. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Gambar 5. Proses pemisahan dengan KLT

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi menggunakan harga R_f meskipun harga-harga R_f dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga R_f didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):

Harga Rf = jarak yang ditempuh senyawa

Jarak yang ditempuh pelarut

Harga-harga R_f untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga R_f yang diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga R_f untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh (Gritter et al, 1991).

Pengukuran lain yang sering dipakai adalah menggunakan pengertian R_x atau R_std yang didefinisikan sebagai berikut (Gritter et al, 1991):

Harga R_x atau R_std = jarak yang ditempuh senyawa yang tidak diketahui

Jarak yang ditempuh pelarut

Jarak yang ditempuh senyawa standart yang diketahui

Senyawa standard biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan senyawa yang dipisahkan pada kromatogram. Misal perbandingan suatu hidrolisa protein dengan glisin atau alanin.

F. Deteksi Bercak

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna, yaitu:

1. Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan, maka sampel akan berpendar.

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika disinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Gambar 6. Deteksi Bercak dengan UV

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan,, kita harus menandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Karena jika kita mematikan sinar UV tersebut, bercak-bercaknya tidak tampak kembali.

2. Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan cara mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Gambar 7. Deteksi Bercak dengan Larutan Ninhidrin

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

G. Penerapan KLT

KLT bisanya merupakan metode pilihan pertama jika sesorang ingin memisahkan suatu campuran. Hal ini disebabkan karena KLT merupakan metode yang sederhana dan cepat. KLT digunakan secara luas untk analisis obat. Berikut adalah penggunaan KLT untuk analisis beberapa sediaan farmasi:

Tabel 2. Penerapan KLT untuk analisis obat (gandjar dan Rohman, 2007)

Obat (sediaan)	Fase diam	Fase gerak	Deteksi
Asetaminofen (serbuk)	Silika gel	Heksan:aseton (75:25)	UV
Albendazol (serbuk)	Silika	Metilen klorid-asam aseat- eter (6:1:1)	UV panjang gelombang pendek
Amoksisilin (tablet, kapsul, suspensi)	Silika	Metanol-piridin-kloroform-air (90:10:80:10)	Ninhidrin
Ampisilin (kapsul, suspensi oral)	Silika	Aseton-toluen-air-asam asetat (650:100:10025)	Ninhidrin
Vitamin C (serbuk)	silika	Metanol-aseton-air (20:40:3)	UV
Dosisiklin	Silika disemprot EDTA 10%, pH 9,0	Metilen klorid-metanol-air (59:35:6)	UV 280 nm
Ketamin (serbuk)	Silika	Benzen-metanol-amonium hidroksida (80:20:1)	Dragendorff
Morfin (penyalahgunaan obat)	Silika (dijenuhkan dengan NaOH 0,1 N)	Dikembangkan dengan cara 2 dimensi: sikloheksan-toluen-dietilamin (75:15:10) lalu kloroform-metanol (9:1)	UV 279 nm
Nifedipin (serbuk)	Silika	Diisopropill eter	UV 254
Nitrofurantoin (serbuk)	Silika	Nitrometan-metanol (9:1)	Dipanaskan, UV 254
Nistatin (salep dengan kliquinol)	Silika	Benzen-metanol (9:1)	UV 254 nm
Progesteron (serbuk)	Silika (yang telah diaktifkan pada suhu 105^oC)	Kloroform-etil asetat (2:1)	UV 241 nm
Prostaglandin (serbuk)	Silika	Etil asetat-isooktan-etanol-asam format (35:0,5;0,1)	Asam fosfomolibdat
Teofilin (kapsul dengan guuaifensin)	Selulosa	Metanol-air	UV 254 nm
Vinblastin (serbuk)	Silika	Benzen-kloroform-dietilamin (40:20:3)	UV 254 nm
Vinkristin (injeksi)	Silika	Eter-metanol-metilamin 40% (40:20:3)	Amonium sulfat

BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan uraian di atas dapat disimpulkan:

1. KLT merupakan bentuk kromatografi planar , yang fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidng datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik.

2. Keuntungan KLT yaitu ketepatan penentuan kadar baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugiannya memerlukan waktu untuk menentuan sistem eluen yang cocok.

3. Prinsip KLT yaitu pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.

4. Fase diam yang sering digunakan pada KLT yaitu silika gel sedangkan fase gerak (eluen) merupakan campuran dari dua pelarut atau lebih.

5. Kerja dengan KLT dimulai dari (1) penyiapan plat, eluen dan sampel, (2) penotolan, (3) elusi, (4) deteksi bercak/noda.

6. Cara mendeteksi bercak ada 2 yaitu menggunakan UV dan campuran zat kimia tertentu.

7. KLT bisa digunakan untuk analisis obat seperti Asetaminofen, Albendazol, Amoksisilin, Ampisilin, dan lain-lain.

B. Saran

Perlu dilakukan kajian lebih mendalam mengenai Kromatografi Lapis Tipis (KLT) mengingat cakupan materinya yang sangat luas.

DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, IG dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.

Gritter RJ, Bobbit JM, Arthur SE. 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung

Hostettmann K, Hostettmann M, Marston A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Penerbit ITB. Bandung.

Kealey D dan Haines PJ. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry. BIOS Scientific Publishers Limited. New York.

Sastroharmidjojo H. 1985. Kromatografi. Penerbit Liberty. Yogyakarta.

Sudjadi.1988. Metode Pemisahan. Penerbit Kanisius.Yogyakarta.

Watson, DG. 2010. Analisis Farmasi. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Endra_Sendana.Blogspot.. "Pharmacy Halu Oleo University '10"

Total Tayangan Halaman

Kamis, 12 Juni 2014

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)