TRANSKRIPSI

TRANSKRIPSI

Transkripsi adalah proses penyalinan kode-kode genetik yang ada pada urutan DNA menjadi molekul RNA.

Mekanisme dasar sintesis RNA

Transkripsi (sintesis RNA) dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu:

1.  Faktor-faktor pengendali transkripsi menempel di bagian promoter, misalnya

RNA polimerase (Inisiasi).

2. Pembentukan kompleks promotor terbuka (open promoter complex). Tidak seperti replikasi di mana DNA benar-benar dibuka,  pada transkripsi pilinan DNA dibuka namun masih tetap di dalam RNA polimerase.

3. RNA polimerase membaca DNA cetakan (template) dan mulai melakukan pengikatan nukleotida yang komplementer (Elongasi).

4. Setelah pemanjangan untaian RNA, diikuti dengan terminasi yang ditandai dengan lepasnya RNA polimerase dari DNA yang ditranskripsi (Terminasi).

Walaupun tahapan-tahapan yang terjadi sama antara eukariot maupun prokariot, namun ada perbedaan fundamental dalam hal struktur gen, faktor-faktor pengendali,  mekanisme  serta  regulasi.  Meskipun  ada  perbedaan,  namun  secara umum pola mekanisme sintesis RNA serupa. Baik pada eukariot maupun prokariot, PRINSIP yang harus di pegang adalah:

1.  Prekursor untuk sintesis RNA ada 4 macam ribonukleotida: 5′-trifosfat ATP, GTP, CTP, dan UTP (tidak ada timin pada RNA).

2.  Reaksi polimerisasi atau pemanjangan RNA sama dengan replikasi DNA yaitu dengan arah 5′    3′ (5’-PO4 ke 3’-OH).

3.  Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA template

(Gambar 5).

4.  Untai DNA yang berperan sebagai cetakan hanya salah satu untai.

5.  Hasil transkripsi berupa molekul RNA untai tunggal.

DNA template

Gambar 5. Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA template. RNA polimerase bekerja dengan membaca template dengan arah 3′ → 5′, namun sintesis mRNA adalah dari 5′ → 3’.

Faktor-faktor pengendali transkripsi, salah satunya adalah Faktor Transkripsi. Terdapat lebih dari 50 protein berbeda dari faktor transkripsi berikatan pada situs promoter, umumnya pada sisi 5’ dari gen yang akan ditranskrip. Kemudian, enzim RNA polimerase berikatan ke kompleks dari Faktor Transkripsi, bekerja sama untuk membuka DNA. RNA polimerase bekerja dengan membaca template dengan arah 3′

→ 5′, namun sintesis mRNA adalah dari 5′ → 3’ . RNA polimerase berjalan sepanjang template DNA, membangun ribonukleotida yang disuplai dari bentuk trifosfat dengan prinsip pasangan basa. Ketika bertemu G, maka pada RNA dimasukkan C, G-C, T-A, A-U (U, dari uridine triphosphate, UTP). Tidak ada T pada RNA.   Ketika transkripsi selesai, transkrip (mRNA) dilepaskan dari polimerase dan polimerae lepas dari DNA.

Transkripsi pada Prokariot

Salah satu ciri dari prokariot adalah adanya struktur operon. Operon adalah organisasi dari beberapa gen yang ekspresinya dikendalikan oleh satu promotor. Misal operon lac, pada metabolisme laktosa pada bakteri E.coli. Masing-masiang gen structural   mempunyai   kodon   inisasi   dan   kodon   terminasi,                                                                                                             tetapi   ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama (Gambar 6). Pada waktu ditranskripsi, operon lac akan menghasilkan satu mRNA yang membawa kode genetik untuk 3 polipeptida berbeda, disebut dengan mRNA polisistronik. Masing-masing polipeptida akan ditranslasi secara independen dari satu untaian mRNA yang sama.

Gambar 6. Organisasi operan lac pada E. coli. Operon lac punya 3 gen struktural yaitu lac Z (mengkode β-galaktosidase), lac Y (mengkode permease) dan lac A (mengkode trans- asetilase). Masing-masing dari gen mempunyai start codon dan stop codon sendiri-sendiri, namun ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter (p) yang sama. Operator (o) adalah bagian dari promoter tempet penempelan protein repressor yang dikode oleh gen I. Catabolite activator protein (CAP). AUG adalah start kodon (materi ini akan dijelaskan lebih dalam setelah mid semester.

Struktur Gen Prokariot

Gen prokariot secara tersusun atas promoter, gen struktural, dan terminator

(Gambar 7).

Gambar 7. Struktur gen prokariot

Promoter adalah urutan DNA spesifik yang berperan dalam mengendalaikan transkripsi gen struktural dan terletak di daerah upstream (hulu) dari bagian struktural gen. Fungsi promoter adalah sebagai tempat awal pelekatan enzim RNA polimerase yang nantinya melakukan transkripsi pada bagian gen struktural. Salah satu bagian penting promoter disebut sebagai Pribnow box pada urutan nukleotida -10 dan -35. Oleh karena urutan consensus pada Pribnow box adalah TATAAT, maka seringkali disebut juga TATA box. Pribnow box berperanan dalam mengarahkan enzim RNA polymerase sehingga arah transkripsinya adalah dari ujung 5’      3’. Selain itu, daerah ini merupakan tempat pembukaan heliks DNA untuk membentuk kompleks promoter yang yang terbuka.

Operator, merupakan urutan nukelotida yang terletak di antara promoter dan bagian struktural dan merupakan tempat pelekatan protein represor (penekan atau penghambat ekspresi gen). Jika ada represor yang melekat di operator maka RNA polimerase tidak bisa jalan dan ekspresi gen tidak bisa berlangsung. Selain adanya supresor  ada  juga  enhancer.  Jika  supresor  untuk  menghambat,  kebalikannya enhancer berfungsi meningkatkan transkripsi dengan meningkatkan jumlah RNA polimerase. Namun letaknya tidak pada lokasi yang spesifik, ada yg jauh di upstream atau bahkan downstream dari titik awal transkripsi.

Coding Region (gen structural) merupakan bagian yang mengkode urutan nukleotida RNA. Transkripsi dimulai dari sekuens inisiasi transkripsi (ATG) sampai kodon stop (TAA / TGA / TAG). Pada prokariot tidak ada sekuens penyisip (intervening sequences atau intron, yang tidak dapat diekspresikan) sehingga semuanya berupa ekson (urutan nukleotida yang mengkode asam amino). Tidak semua gen mengkode urutan asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. Gen dibagi menjadi

3 kelompok yaitu gen yang mengkode protein, gen yang mengkode RNA ribosom (rRNA) dan gen yang mengkode transfer-RNA (tRNA). Gen yang mengkode rRNA dan tRNA hanya akan ditranskripsi dan tidak pernah ditranslasi karena yang diperlukan dalam proses ekspresi genetic adalah molekul RNA-nya. rRNA digunakan untuk menyusun ribosom (tempat sintesis protein) sedangkan tRNA berfungsi membawa molekul  asam  amino  spesifik  yang  akan  dirangkaikan  menjadi  polipeptida  dalam proses sintesis protein.

Terminator, adalah bagian gen yang terletak di sebelah hilir dari gen structural. Fungsinya     adalah                     memeberikan                  signal    pada    enzim    RNA   polymerase    agar menghentikan proses transkripsi. Signal terminasi dicirikan oleh struktur jepit rambut/hairpin dan lengkungan yang kaya yang akan urutan GC yang terbentuk pada molekul RNA hasil transkripsi.

RNA Polimerase, merupakan enzim yang mengkatalisis proses transkripsi. Susunan  lengkap adalah  α2ββ’σ  disebut  holoenzim,  jika  σ  tidak  ada  dan  hanya ada α2ββ’ disebut core-enzyme. Fungsi subunit-subunit tersebut adalah: α = diduga berfungsi dalam penyusunan enzim, β = berfungsi dalam pengikatan nukleotida, β’ = berfungsi dalam penempelan DNA, σ = berfungsi untuk mengarahkan agar RNA polimerase menempel pada promoter.

MEKANISME TRANSKRIPSI PADA PROKARIOT

Tahapan transkripsi terdiri dari inisiasi, elongasi, dan terminasi.

Inisiasi. Transkripsi dimulai dengan penempelan RNA polimerase holoenzim pada bagian promoter. RNA polimerase menuju ke promoter atas bantuan faktor σ yang mampu menemukan bagian promoter suatu gen. Bisa diibaratkan RNA polymerase adalah pesawat, faktor sigma adalah antenanya, promoter adalah bandaranya. Pada prokariot, RNA polymerase menempel secara langsung pada DNA di daerah promoter tanpa melalui ikatan dengan protein lain (pada eukariot protein pembantu dibutuhkan sangat banyak !!).

Kemudian, bagian DNA yang berikatan dengan RNA polimerase membentuk struktur gelembung transkripsi (transcription bubble) yang stabil. Selanjutnya adalah penggabungan beberapa nukleotida awal sekitar 10 nukleotida. Basa-basa RNA yang digabung membentuk ikatan hidrogen dengan basa DNA cetakan. Selanjutnya adalah pelepasan subunit σ setelah terbentuk molekul RNA sepanjang 8-9 nukleotida. Terjadi perubahan konformasi holoenzim jadi core enzyme (tanpa faktor σ). Faktor σ selanjutnya dapat digunakan lagi dalam proses inisiasi transkripsi selanjutnya (dapat digunakan oleh enzim inti RNA polimerase lain) (Gambar 8).

Gambar 8. Proses inisiasi transkripsi pada prokariot. Faktor sigma membantu mengenali promoter suatu gen.

Pada elongasi, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3′ molekul RNA yang baru terbentuk dengan arah 5′      3′ pada ikatan fosfodiester (Gambar 9). Nukleotida RNA yg ditambahkan bersifat komplementer dengan nukleotida untai DNA cetakan.

Gambar 9. Proses pembentukan ikatan fosfodiester. Gugus OH pada posisi 3’ menyerang posphat pada posisi 5’ melepas 2P dan molekul H2O membentuk ikatan fosfodiester yang stabil.

Penghentian transkripsi (terminasi) ada 2 macam yaitu:

1.  Rho-independent  yaitu  terminasi  yang  dilakukan  tanpa  harus  melibatkan protein khusus, namun ditentukan oleh adanya urutan nukleotida tertentu pada bagian terminator. Ciri urutan adalah adanya struktur jepit rambut/hairpin yang kaya  akan  basa  GC.  Akibat  struktur  itu,  RNA  polimerase  berhenti  dan membuka bagian dari sambungan (hibrid) DNA-RNA. Sisa hibrid merupakan urutan oligo U (rU) yang tidak cukup stabil berpasangan dengan A (dA)   ikatan hidrogen hanya 2 buah, akibatnya ikatan lemah terlepas dan RNA hasil transkripsi lepas.

2.  Rho-dependent yaitu terminasi memerlukan protein rho. Faktor rho terikat pada RNA transkrip kemudian mengikuti RNA polimerase sampai ke daerah terminator. Faktor rho membentuk destabilisasi ikatan RNA-DNA hingga akhirnya RNA terlepas.

TRANSKRIPSI PADA EUKARIOT Struktur gen

Gen-gen pada eukariot bersifat monosistronik, artinya satu transkrip yang dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Pada eukariot tidak dikenal namanya operon karena satu gen structural dikendalikan oleh satu promoter. Secara umum hampir sama sama prokariot yaitu adanya promotor,  bagian struktural dan terminator.  Bagian yang  membedakan adalah pada  bagian  struktural gen.  Bagian struktural/coding region pada eukariot ada bagian intron dan ekson (Gambar 10). Intron  (intervening  sequences)  merupakan  sekuens  yang  tidak  mengkode  asam amino. Bagian ini akan dibuang saat RNA processing. Ekson merupakan sekuen yang dikode menjadi asam amino (Gambar 10).

Gambar 10. Bagian struktural gen eukariot

Mekanisme Transkripsi Pada Eukariot

RNA polimerase pada eukariot bermacam-macam yaitu RNA polimerase I (mentranskrip  gen kelas  I  yaitu  gen  rRNA  kecuali  5S  rRNA),  RNA  Polimerase  II (mensintesis mRNA dan small nulear RNA/snRNA yang diperlukan pada saat RNA splicing) dan RNA polymerase III (mentranskrip gen kelas III yaitu tRNA, 5S rRNA). Pada bab ini hanya dijelaskan RNA polimerase II karena terlibat pada transkripsi semua gen.

Berbeda dengan prokariot, RNA polymerase eukariot tidak menempel secara langsung pada DNA di daerah promoter namun melalui perantaraan protein-protein lain disebut faktor transkripsi/transcription factor (TF). TF ada 2 macam yaitu ada yang umum dan ada yang khusus. TF umum berfungsi mengarahkan RNA polymerase ke promoter. TF umum meiputi TFIIA, B, D, E, F, H, J (transcription factors regulating RNA pol II). Penempelan RNA polymerase [ada promoter oleh daktor transkripsi umum hanya menghasilkan transkripsi pada aras dasar (basal level). Pengaturan yang lebih spesifik dilakukan oleh FT yang khusus untuk suatu gen.

Promoter eukariot sangat beragam dan sulit untuk dikarakterisasi. Basal promoter       elements                   dikenal       dengan    TATA-box                    dan    CCAAT-box,   dinamakan berdasarkan sekuen motifnya (Gambar 11). TATA-box berada pada 20 sampai 30 basa  upstream  dari  transcriptional  start  site  dan  ini  sama  dengan  sekuen  pada prokariot  atau  Pribnow-box  (sekuen  konsensusnya  adalah  TATAAA,  TATAT/AAT/A,

dimana T/A  menandakan basa yang mungkin ditemukan pada posisi tersebut). TFIID

adalah faktor transkripsi pertama yang secara langsung berikatan dengan TATA box dan penempelan ini mengarahkan faktor transkripsi lainnya dan RNA polymerase II untuk mengenali promoter. TFIID sebenarnya merupakan kompleks protein yang terdiri dari protein pengikat kotak TATA (TATA-box binding protein, TBP) dan TAF (TBP- associated factors).  CCAAT-box terdapat  pada posisi  -100.  CCAAT-box diketahui mengikat protein FT CCAAT-binding transcription factor (CTF) dan CCAAT-enhancer- binding protein (C/EBP).

Gambar 11. Struktur umum dari gen eukariot

Ada banyak regulator lain pada urutan gen, yaitu tempat berikatannya berbagai faktor transkripsi (Gambar 12). Urutan regulator ini sebagian besar adalah terletak hulu (5')  dari situs  inisiasi transkripsi,  meskipun beberapa  elemen  terjadi  hilir  (3')  atau bahkan di dalam gen itu sendiri. Jumlah dan jenis elemen regulator ditemukan bervariasi tiap masing-masing gen. Kombinasi yang berbeda dari faktor transkripsi ini

memberikan efek yang berbeda. Berbagai jenis sel mengekspresikan kombinasi karakteristik  dari faktor transkripsi,  dan ini menghasilkan  mekanisme  utama  untuk kekhususan tipe sel dalam regulasi ekspresi gen.

Gambar 11. Struktur bagian upstream gen eukariot. Dihipotesiskan terdiri dari 2 ekson dan

1 intron. Diagaram menunjukkan adanya TATA-box dan CCAAT box basal element masing- masing pada posisi -25 dan -100. FTIID terlihat berikatan dengan TATA-box binding protein, TBP. [CREB = cAMP response element binding protein] [C/EBP = CCAAT-box/enhancer binding protein]. Lingkaran besar hijau menggambarkan RNA polymerase II.

Source: http://themedicalbiochemistrypage.org/gene-regulation.html

Tabel 1. Eukaryotic promoter elements

Kebanyakan walau tidak semua, CAAT dan GC-box berlokasi antara -200 dan -70. N = any (A, T, C, atau G), Py (pirimidin = C atau T). Penghilangan atau mutasi pada GC box dapat menghilangkan aktivitas promoter. Selain sekuen di atas, GC box juga mempunyai sekuen CCGCCC.

Table 2. Daftar Beberapa Faktor Transkripsi

Faktor transkripsi	Sequence Motif	Komentar
MYC and MAX	CACGTG	MYC pertama kali diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; MAX secara khusus bergabung dengan MYC di sel
FOS and JUN	TGAC/ TC/ A G      A	Keduanya pertama kali ditemukan sebagai onkogen retrovirus; bergabung di sel, dikenal juga sebagai faktor transkripsi AP- 1
CREB	TGACGC/ C/ G/ T    A    A	Terikat pada cAMP response element (CRE); family minimal ada 10 factor transkripsi hasil dari gen yang berbeda

		atau alternative splicing; dapat membentuk dimer dengan JUN
ERBA; also TR (thyroid hormone receptor)	GTGTCAAAGGTCA	Pertama diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; member of the steroid/thyroid hormone receptor superfamily; binds thyroid hormone
ETS	G/ A/ GGAA/ GT/ C   C            T       C	Pertama diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; mendominasi pada sel B dan T
GATA	T/ GATA A	Family dari erythroid cell-specific factors, GATA-1 sampai -6
MYB	T/ AACG/ G C            T	Pertama diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; hematopoietic cell-specific factor
MYOD	CAACTGAC	master kontrol diferensiasi sel otot
NFκB and REL	GGGAA/ TNT/ CC(1) C         C	kedua faktor diidentifikasi secara independen; REL pertama kali diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; mendominasi dalam sel B-dan -T
RAR (retinoic acid receptor)	ACGTCATGACCT	mengikat pada elements disebut RAREs (retinoic acid response elements) juga mengikat situs JUN/FOS
SRF (serum response factor)	GGATGTCCATATTAGGACATCT	Terdapat banyak dalam gen yang diinduksi oleh faktor-faktor pertumbuhan yang ada pada serum

Daftar ini hanya mewakili ribuan dari faktor transkripsi yang telah diidentifikasi. N menandakan segala macam basa dapat menduduki posisi ini.

Proses  pemanjangan  transkrip  berlangsung  sama  seperti  pada  prokariot. Proses ini akan berlangsung sampai RNA polymerase II mencapai daerah terminator. Terminasi transkripsi dapat terjadi karena adanya aktivitas fosfatase yang spesifik untuk CTD sehingga mengembalikan RNA polymerase II menjadi bentuk yang tidak terfosforilasi. Pada keadaan ini, RNA polymerase dapat digunakan secara berulang- ulang.

Proses pasca-transkripsi

Pre-mRNA yg dihasilkan dari proses transkipsi tidak bisa langsung dikeluarkan ke sitoplasma untuk ditranslasi namun harus dimodifikasi dahulu.

1.  Pemberian topi (capping) dan ekor (poliadenilasi)

Setiap ujung molekul pre-mRNA dimodifikasi dengan cara tertentu.  Ujung  5’ yaitu ujung depan, pertama kali dibuat saat transkripsi segera ditutup dengan mukleotida guanin (G) yang termodifikasi. Pemerian topi ini mempunyai setidaknya 2 fungsi.

a.  Ujung ini melindungi mRNA dari degradasi  enzim hidrolisis.

b.  Setelah mRNA sampai di sitoplasma, ujung 5’ berfungsi sebagai bagian dari tanda “lekatkan di sini” untuk ribosom.

Pada ujung 3’ suatu enzim menambahkan ekor polia(A) yang terdiri dari 30-200 nukleotida adenin. Ekor poli(A) berfungsi mempermudah ekspor mRNA dari nukleus.

Gambar 12. Capping dan pemberian ekor pada mRNA

Poliadenilasi merupakan proses penambahan poliA (rantai AMP) pada ujung 3′ nukleotida mRNA. Fungsinya untuk meningkatkan stabilitas mRNA dan meningkatkan efisiensi translasi.

2.  Splicing

Saat proses transkripsi, RNA polimerase mentranskripsi intron maupun ekson dari DNA.  Splicing  merupakan  proses  pembuangan  intron  dan  penyambungan  ekson. Intron adalah bagian penyela, merupakan segmen asam nukleat bukan pengkode dan terletak diantara daerah pengkode. Sedangkan ekson adalah daerah yang yang diekspresikan  atau  ditranslasi  menjadi  asam  amino.  Dalam  penyambungan  RNA, intron dikeluarkan dan ekson bergabung. Penyambungan RNA dikatalis oleh ribonukleoprotein nucleus kecil (snRNP), yang beroperasi de dalam susunan yang lebih besar disebut spliosom. Setelah dilakukan berbagai modifikasi di atas, jadilah mRNA matang (mature mRNA) (Gambar 13).

Gambar 13. Proses splicing

Alternatif splicing

Gambar 14. Alternative splicing memberikan hasil protein yang berbeda

NOTE:

Proses  pembentukan  RNA  dari  DNA  dinamakan  transkripsi,  dilakukan  oleh  RNA

polymerase.

Pada kebanyakan virus, materi genetik berupa RNA sehingga ketikan menginfeksi host, materi genetik di retro-transkripsi dari RNA menjadi cDNA (complement DNA) oleh ennzim Reverse trancriptase.