KROMATOGRAFI KOLOM
DAN LAPIS TIPIS
A.
Tujuan Percobaan
Setelah
melakukan percobaan ini mahasiswa diharapkan dapat:
1. Melakukan teknik-teknik dasar kromatografi
grafitasi dan lapis tipis pada proses isolasi dan pemurnian senyawa bahan alam.
2. Menjelaskan perbedaan prinsip dasar kromatografi
grafitasi dan lapis tipis.
B.
Landasan Teori
Wortel merupakan salah satu jenis tanaman sayuran yang dapat
digunakan untuk membuat bermacam-macam masakan. Umbi wortel juga dapat memiliki
kegunaan sebagai bahan obat-obatan untuk mengobati beberapa jenis penyakit.
Senyawa β-karoten pada tanaman wortel dapat menimbulkan kekebalan tubuh
terhadap penyakit tumor, menghambat penyebaran sel kanker, dan mengaktifkan
enzim pelawan kanker. Selain itu, senyawa karoten (pro-vitamin A) dapat
mencegah penyakit rabun senja. Umbi wortel juga mengandung alakloida akonitina
atau asetbencilakonin, benzoilakonina, akonina, dan neupelina (Cahyono, 2002).
Jenis senyawa karoten yang
paling berlimpah di alam adalah β-karoten yang merupakan senyawa provitamin A,
memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat. Senyawa antioksidan akan
berinteraksi dalam tubuh manusia secara sinergis dengan senyawa antioksidan
lain untuk melindungi kerusakan yang diakibatkan oleh reaksi oksidasi. Sebagai
contoh, vitamin E dapat memproteksi molekul β-karoten dari peristiwa oksidasi (sparing
effects) (Michel P.J. and Liñan-Cabello, M. 2000).
Sumber utama β-Karoten yaitu wortel, namun jika dikonsumsi
dalam jumlah besar akan dapat membahayakan karena mengandung substansi
nitrosamid, nitrit dan falcarinol (Suwandi, 1991). Kandungan karotenoid dalam
wortel dapat dilihat dari intensitas warnanya, yaitu semakin jingga warna
wortel maka semakin banyak kandungan karotenoidnya. Karotenoid yang dikandung
tidak hanya beta karoten tetapi juga alfa karoten, gamma karoten, zeta karoten,
dan likopen yang dapat memberikan perlindungan pada tubuh terhadap pengaruh
negatif dari radikal bebas (Soebagio et al., 2007).
Dalam kromatografi
adsorbsi, digunakan zat padat sebagai adsorben yang bertindak sebagai fasa
stasioner dan menggunakan zat cair sebagai fasa mobil. Permukaan partikel padat
biasanya lebih aktif dari pada bagian dalamnya yang umum dikatakan mempunyai
aktifitas permukaan. Bila partikel tersebut dimasukkan kedalam suatu larutan,
permukaan partikel tadi mempunyai daya tarik baik pada zat-zat yang terlarut
maupun pada zat pelarutnya. Silika gel mempunyai luas permukaan yang lebih
besar, tetapi mempunyai aktifitas kimia yang lebih kecil dan lebih disukai
untuk pemisahan senyawa-senyawa organik yang peka terhadap perubahan-perubahan
karena aktifitas permukaan yang mempunyai sifat katalik (Adnan, 1997).
C.
Alat dan Bahan
1. Alat
·
Pisau
·
Gelas kimia
·
Ampul
·
Gelas ukur
·
Penusuk (kayu)
·
Satu set alat refluks
·
Corong
Buchner (penyaring vakum)
·
Alat
destilasi
·
Penangas
air
·
Kolom
kromatografi
·
Pipa
kapiler
·
Chamber
KLT
·
Lampu
UV
·
Evaporator
2. Bahan
·
Wortel
·
Batu didih
·
Diklorometan
·
n-heksan
·
Metanol
·
Kapas
·
Silika gel
·
Plat KLT
·
Plat KLT preparative
·
Kertas saring
·
D.
Prosedur Kerja
Prosedur Kerja  |
|||
|
|||
E.
Hasil Pengamatan
|
No.
|
Variabel yang Diamati
|
Hasil Pengamatan
|
|
1.
2.
3.
4.
5.
|
Wortel
Direfluks kurang lebih 1
jam menggunakan pelarut diklorometan 50 ml.
Dievaporasi
Residu dikromatografi
menggunakan kromatografi grafitasi.
Fraksi dari kromatografi
grafitasi di analasis menggunakan KLT
|
± 20
gram
Ekstrak wortel berwarna orange
Residu
Menghasilkan fraksi
|
F. Pembahasan
Kunyit adalah
jenis tumbuhan rimpang dengan warna kuning kemerah-merahan pada rimpangnya. Di
dalam kunyit telah dikatahui mengandung senyawa kurkumin. Kurkumin
adalah senyawa turunan fenolik dari hasil isolasi rimpang tanaman kunyit (Curcuma
longa). Zat ini adalah
polifenol dengan rumus kimia C21H20O6.
Kurkumin dapat memiliki dua bentuk tautomer: keton dan enol. Struktur
keton lebih dominan dalam bentuk padat, sedangkan struktur enol ditemukan dalam bentuk cairan. Senyawa ini memiliki rumus molekul 2 gugus vinilguaiacol yang saling dihubungkan
dengan rantai alfa beta diketon.
Pada
percobaan ini, kita akan memisahkan dan memurnikan β-karoten
dari ekstrak wortel dengan meggunakan metode kromatografi kolom dan kromatografi
lapis tipis. Terlebih dahulu kita mengisolasi senyawa β-karoten tersebut dengan
cara merefluks sampel wortel.
β-karoten merupakan pigmen berwarna kuning. Kromofor
dalam β-karoten merupakan sistem 11 ikatan rangkap terkonjugasi geometris
trans. Sifat kromofor dari struktur senyawa ini mudah dikenali di bawah lampu
UV sehingga memudahkan identifikasi dalam kromatografi lapis tipis. Pada metode
isolasi senyawa β-karoten dengan cara refluks yaitu tejadi penarikan
komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke dalam labu alas
bulat bersama-sama dengan zat pelarut (kloroform)
lalu dipanaskan dan diberikan batu didih agar pemanasan
berlangsung secara merata. Uap-uap pelarut
terkondensasi pada kondensor menjadi molekul-molekul pelarut yang akan turun
kembali menuju labu alas bulat, dan akan akan menyari kembali sampel yang
berada pada labu alas bulat. Demikian seterusnya berlangsung secara
berkesinambungan sampai penyarian sempurna, setelah itu filtrat yang diperoleh
dipekatkan dengan cara evaporasi. Evaporasi yaitu proses pemisahan ekstrak dari cairan penyaringan dengan
pemanasan yang dipercepat oleh putaran dari labu alas bulat. Dengan bantuan
pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan mengalami
kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung dalam
labu alas bulat.
Setelah ekstrak
dievaporasi kemudian dilanjutkan proses pemisahan dengan menggunakan metode
kromatografi kolom. Kromotografi kolom adalah suatu
metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan
daya adsorbsi suatu adsorben tentang terhadap suatu senyawa, baik pengotornya
maupun hasil isolasinya.
Pada metode ini, kolom diisikan dengan adsorben yang berupa padatan dalam hal ini adalah silika gel yang
dicampurkan dengan pelarut n – heksan hingga membentuk bubur silika (slurry). Slurry dimasukkan dengan hati-hati
ke dalam kolom kromatografi yang telah diisikan n-heksan yang sebelumnya telah disumbat dengan
kapas dan kertas saring yang berfungsi sebagai penahan adsorben agar tidak
keluar bersama eluen. Pengisian kolom harus dikerjakan secara seragam dan
sepadat mungkin untuk menghindari terjadinya gelembung-gelembung udara. Jika
terdapat gelembung-gelembung udara dalam kolom maka akan berpotensi menyebabkan
pecahnya kolom.
Hal lain
yang dapat dilakukan agar tidak terjadi pemecahan kolom adalah dengan
menambahkan eluen secara kontinu agar udara tidak masuk ke dalam kolom. Kolom
yang padat diindikasikan dengan warna slurry yang semakin memutih dan kecepatan
alir eluen yang semakin lambat. Jika kolom sudah memadat, larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom.
Mekanisme
yang terjadi pada kromatografi kolom ialah sample akan terelusi oleh eluen (n-heksan) melalui fase
diam silika gel. Senyawa organik terelusi oleh eluen proses elusi terjadi karena
keseimbangan distribusi zat analit pada fase gerak n-heksan dan fase diam
selika gel. Elusi terus berlangsung hingga tidak ada lagi yang tinggal dalam
kolom. Proses elusi ini menghasilkan eluat yang diharapkan mengandung banyak betakaroten.
Eluat yang didapatkan kemudian diuji kemurniannya melalui proses Kromatografi Lapis
Tipis (KLT). Seperti yang kita ketahui, KLT ini pemisahan
perbedaan distribusi antara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam
yang digunakan pada percobaan ini adalah plat, dan fasa gerak yang kami gunakan
adalah heksan dengan etil dengan perbandingan tertentu. Eluen inilah yang
mengelusi campuran/senyawa dari ujung yang satu keujung yang lainnya. Eluen
digunakan adalah n-heksan dan aseton dengan perbandingan 8:2 setelah eluen naik
keatas, dimana kompenen yang lebih kuat diaserap oleh adsorben akan lebih
lambat naiknhya dan kompenen yang kurang diserap oleh adsorben akan lebih cepat
naiknya pada plat. Maka plat KLT dikeluarkan dari chamber, dan dikeringkan dan
hasilnya dilihat pada/dibawah sinar uv. Dari pengamatan yang terlihat terbentuk beberapa noda dengan
jarak gerak yang berbeda.
Rate of flow (Rf) adalah harga perbandingan jarak yang
ditempuh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh pelarut adalah dasar untuk
mengidentifikasi komponen yang terdapat yang terdapat dalam ekstrak berupa
noda-noda, yang timbul pada pelat. Selain memberi informasi nilai Rf, bentuk noda yang nampak pada plat
juga dapat memberi keterangan tentang keterangan tentang keadaan pengerjaan. Rate of Law (Rf) dari ekstrak β-karoten hanya terdapat pada fraksi kedua dan
keempat masing – masing sebesar 0.36 dan 0.25 sedangkan pada
fraksi pertama dan ketiga tidak terdapat bercak noda. Hal ini dapat terjadi kemungkinan dikarenakan
oleh ekstrak yang diperoleh kurang murni atau bisa saja karena perbandingan
pelarut yang digunakan kurang tepat untuk menarik noda atau spot ketika dielusi
pada plat KLT.
G.
Kesimpulan
Adapun
kesimpulan yang dapat diperoleh dari percobaan ini antara lain adalah :
1. Pemisahan
komponen-komponen dalam sampel dengan menggunakan kromatografi kolom dilakukan
dengan mengelusi sampel tersebut dalam suatu kolom dengan fasa diam berupa
padatan seperti silika gel dan fasa gerak berupa campuran pelarut. Sedangkan
pada KLT sampel ditotolkan pada pelat, lebih lanjut dikembangkan dalam sistem
pelarut yang telah jenuh yang kemudian identitasnya dinyatakan dengan harga Rf.
2. Perbedaan
antara kromatografi kolom dan KLT adalah Kromatografi kolom menggunakan kolom sebagai media
pemisahan sedangkan KLT menggunakan pelat tipis. Dalam proses elusinya, kromatografi
kolom memanfaatkan gaya grafitasi sedangkan pada KLT
memanfaatkan gaya kapilaritas.
DAFTAR PUSTAKA
Adnan, J.M., 1997, Kimia
Makanan, ITB, Bandung.
Cahyono, B., 2002. Wortel (Tekhnik Budidaya Dan Analisis Usaha
Tani). Kanisus. Yogyakarta.
Michel P.J. and Liñan-Cabello, M. 2000. “Carotenoids and Retinoids Metabolites as Precursors of
Receptors-Specific Bioactive Compounds. Advances in hrimp.Avances en Nutrición
acuícola V. Memorias del V Simposium Internacional de Nutrición Acuícola.
19-22 Noviembre, 2000. Mérida, Yucatán, Mexico.
Soebagio, B., Rusdiana,
T., Risnawati, R., 2007, Formulasi gel antioksidan dari ekstrak umbi wortel
(daucus carota l.) Dengan menggunakan aqupec HV-505, Makalah pada Kongres
Ilmiah XV ISFI, Jakarta.
Suwandi,
U., 1991, Manfaat Beta-Karoten bagi
Kesehatan, Cermin Dunia Kedokteran, No. 73.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar