PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROORGANISME

BAB I

PENDAHULUAN

A.  Latar Belakang

Mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu. 

Persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri untuk akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Pengecatan atau pewarnaan dapat memperlihatkan bentuk dan bagian-bagian bakteri sesuai dengan warna larutan dan sifat keasamannya. Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas pengecatan sederhana dan pengecatan diferensia

B.  Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari percobaan ini yaitu:

1.     Apakah dasar kimiawi dan teoritis dari pewarnaan bakteri ?

2.     Bagaimana tehnik pembuatan apusan dalam pewarnaan bakteri ?

3.     Bagaimana tata cara dalam pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram ?

C.  Tujuan

Tujuan dari percobaan ini yaitu:

1.    Untuk mempelajari dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan bakteri

2.    Untuk mempelajari teknik pembuatan apusan dalam pewarnaan bakteri

3.    Untuk mempelajari tata cara pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram

4.     

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme adalah jasad renik yang berukuran sangat kecil. Mikroorganisme dibagi atas beberapa kelompok. Salah satu jenis mikroba yaitu bakteri, dimana bakteri terdapat hampir diseluruh tempat tanpa kita ketahui. Ukurannya kecil dan warnanya yang hampir sama dengan tempat hidupnya. Dalam mikrobiologi perlu dipelajari ciri-ciri koloni, sifat biokimia, morfologi, reaksi pengecatan, reaksi imunologi, dan kerentaan bakteri pada zat antibakteri (Irianto, 2006:124-127).

Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar, mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme, dan membantu mengidentifikasi juga membedakan organisme yang serupa. Sedangkan langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik antara lain, penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek, fiksasi olesan itu pada kaca objek, serta aplikasi tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial) (Pelczar dan Chan, 1986:81-82).

Untuk mewarnai bakteri, ada beberapa hal yang diperhatikan, yaitu bakteri haruslah diambil dari suatu piaraan yang masih muda untuk memperlihatkan bentuk morfologinya, bakteri diratakan di atas kaca benda yang bersih, jika sudah kering sediaan perlu dilewatkan nyala api perlahan-lahan supaya bakteri itu benar-benar melekat pada kaca benda, zat warna diteteskan pada bidang yang mengandung bakteri, juga mungkin seluruh kaca benda tersebut direndam miring dalam zat warna. Zat warna diberi waktu beberapa lama agar diresap oleh bakteri yang sudah kering (Dwidjoseputro, 2003:15-16).

Cara pengecatan dapat dibedakan atas beberapa  yaitu : Pengecatan Sederhana, tujuan pengecatan ini untuk membedakan bakteri dari benda yang bukan bakteri dan ukurannya, dan terdiri dari satu macam zat pengecat .Pengecatan Diferensia, yaitu pengecatan yang digunakan untuk membedakan bagian bakteri dan menggunakan lebih dari satu  macam zat pengecat. Pewarnaan ini diciptakan oleh hans Christian Gram pada tahun 1884, pewarnaan ini dapat digunakan untuk membedakan bakteri positif dan bakteri negative (Pratiwi, 2008:17-26).

Bakteri yang telah diberi warna dapat dilihat bentuknya dengan mikroskop cahaya. Bentuk bakteri juga digunakan untuk mengidentifikasi bakteri misalnya. Bentuk bakteri bulat (Coccus) dapat dibedakan atas : Monococcus, Diplococcus, Sarkina, Streptococcus dan Stafilococcus. Bentuk basil dapat dibedakan atas: basil tunggal, Diplobasil, dan Streptobasil. Bakteri berbentuk Melilit dapat dibedakan atas: Spiral, Vibrio, dan Spirochaeta (James et all, 2008:115).

BAB III

METODE PRAKTIKUM

A.  Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis tanggal 5 April 2012 pukul 01.00 WITA – selesai dan bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Haluoleo.

B.  Alat dan Bahan

1.    Alat

Alat – alat yang digunakan pada percobaan dapat dilihat dalam tabel 1.

Tabel 1. Alat – alat yang digunakan beserta fungsinya

No.	Nama Alat	Kegunaan
1.	Mikroskop	Untuk mengamati mikroorganisme
2.	Kaca objek	Tempat menyimpan preparat
3.	Jarum ose (bulat)	Untuk mengambil mikroorganisme
4.	Pembakar spiritus	Untuk memijarkan atau sterilisasi secara manual
5.	Tabung reaksi	Tempat mengembangbiakkan bakteri
6.	Tissue	Untuk membersihkan kaca objek setelah disemprot alkohol
7.	Pipet tetes	Untuk mengambil dan meneteskan larutan

2.    Bahan

 Bahan – bahan yang digunakan pada percobaan kali ini dapat dilihat pada tabel 2.

Tabel 2. Bahan – bahan yang digunakan beserta fungsinya

No.	Nama Bahan	Kegunaan
1.	Akuades	Untuk mencuci dan membilas kaca objek
2.	Kultur bakteri	Sebagai objek pengamatan
3.	Alkohol 70%	Untuk mensterilkan kaca objek dan sebagai larutan pemudar
4.	Larutan kristal violet	Sebagai zat pewarna pada pewarnaan gram
5.	Larutan lugol	Untuk menetesi apusan yang telah dicuci
6.	Larutan safranin	Sebagai zat pewarna pada pewarnaan gram

C.  Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan pada praktikum ini adalah :

1.    Pewarnaan sederhana

a.    Mensterilkan kaca objek dengan menyemprotan alkohol kemudian memfiksasi dengan pembakar spiritus

b.    Membuat preparat olesan bakteri pada kaca objek kemudian memfiksasi dengan pembakar spiritus

c.    Meneteskan larutan Kristal violet diatas preparat olesan tersebut sebanyak 1-3 tetes, biarkan selama 30 detik

d.   Mencuci dengan air mengalir sampai zat sisa tercuci habis, kemudian memfiksasi dengan pembakar spiritus

e.    Diamkan selama 30 menit, kemudian melakukan pengamatan dibawah mikroskop dimulai dengan perbesaran terkecil (40x)

f.     Mengambil gambar dengan menggunakan kamera

2.    Pewarnaan gram

a.    Mensterilkan kaca objek dengan penyemprotan alkohol kemudian memfiksasi dengan pembakar spiritus

b.    Membuat preparat olesan bakteri pada kaca objek kemudian memfiksasi dengan pembakar spiritus

c.    Meneteskan larutan kristal violet sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri, biarkan selama 30 detik

d.   Mencuci dengan air kemudian memfiksasi dengan pembakar spiritus

e.    Meneteskan larutan lugol, biarkan selama 30 detik

f.     Mencuci dengan air dan keringkan

g.    Menetesi larutan alkohol dan biarkan selama 4 detik

h.    Mencuci dengan air dan keringkan

i.      Meneteskan larutan safranin, biarkan selama 30 detik kemudian mencuci dengan air dan dikeringkan dengan pembakar spiritus

j.      Mengamati dibawah mikroskop dimulai dengan perbesaran terkecil (40x)

k.    Mengambil gambar dengan menggunakan kamera

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.  Hasil Pengamatan

Hasil pengamatan  pada praktikum pengecatan dan morfologi mikroorganisme  adalah:

1.    Pengamatan Pewarnaan Sederhana

1

Perbesaran 40 x 10 kali

Keterangan :

1. Cocus

2.    Pengamatan Pewarnaan Gram

a.       Gram Positif (+)

1

Perbesaran 40 x 10 kali

Keterangan :

1.    Cocus

b.      Gram Negatif (-)

1

Perbesaran 40 x 10 kali

Keterangan :

1.         Basil

B.   Pembahasan

Bakteri bersifat transparan, berukuran kecil sehingga tidak dapat dilihat secara langsung tanpa alat yang mempunyai pembesaran dan bisa saja teknik khusus. Untuk mengetahui struktur, morfologi dan sifat kimia bakteri, kita perlu melakukan pengecatan terhadap bakteri tersebut. Sebagian besar bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka suasana yang basa). Sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna merupakan senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.

Pewarnaan sederhana bertujuan untuk membedakan bakteri dari benda yang bukan bakteri dan ukurannya, zat pewarna digunakan untuk mewarnai seluruh sel dari bakteri sehingga bentuk bakteri terlihat dengan menggunakan mikroskop cahaya. Sedangkan pengecatan diferensia yaitu pengecatan yang digunakan untuk membedakan bakteri atau mengidentifikasikan jenis – jenis bakteri yang terdapat pada media, zat yang digunakan lebih dari satu  macam zat pengecat. Pewarnaan ini dapat digunakan untuk membedakan bakteri positif dan bakteri negative.

Pada praktikum ini dilakukan pewarnaan sederhana dan pewarnaan diferensial pada sampel. Sampel yang digunakan adalah biakan bakteri yang telah berumur lebih dari 24 jam. Larutan yang digunakan untuk pewarnaan sederhana yaitu safranin, biakan yang telah digoreskan pada kaca objek kemudian diberi safranin dan ditunggu selama 30 detik, agar zat warna dapat terserap, setelah itu dibilas dengan akuades, dan diamati bentuknya di mikroskop cahaya.

Pewarnaan yang selanjutnya yaitu pewarnaan diferensial, pewarnaan ini menggunakan pewarna yang lebih sari satu yaitu larutan kristal violet, larutan lugol, , alkohol 70% dan larutan safranin. Bakteri yang telah digoreskan dikaca objek ditetesi warna yang pertama yaitu kristal violet, larutan ini merupakan pewarnaan utama dan dibiarkan selama 30 detik, lalu dibilas dengan akuades, setelah itu kaca objek ditetesi lagi dengan larutan lugol. Larutan lugol merupakan larutan pewarna mordan yang bertujuan untuk pengitensifan pewarnaan utama. Kemudian kaca objek dibilas lagi. Setelah itu kaca objek ditetesi larutan  alkohol 70% selama 4 detik, larutan ini digunakan untuk pencucian yang merupakan larutan pencuci atau peluntur cat yang terakhir adalah diberikan larutan safranin sebagai pewarna penutup. Setelah itu dibilas dan dibiarkan selama 30 menit, untuk selanjutnya diamati dengan mikroskop cahaya.

Pada pengamatan pewarnaan kultur bakteri menggunakan metode pewarnaan sederhana, didapatkan morfologi bakteri dengan bentuk cocus. Cocus adalah kelompok bakteri yang berbentuk bulat terdapat tunggal atau berpasangan dalam rantai, paket atau bergerombol.

Dinding sel bakteri gram negatif banyak mengandung lipida tinggi, sehingga pencucian dengan larutan pemucat menyebabkan pori-pori membesar dan mengakibatkan permeabilitas zat warna. Pencucian menyebabkan kompleks zat warna luntur dan sel mengambil zat warna sekunder yaitu merah. Pada bakteri gram positif, mengandung sedikit lipid sehingga waktu penambahan alkohol, terjadi pengecilan pori-pori yang menyebabkan zat primer tetap terikat dan dinding sel tetap bewarna ungu.

Pada pengamatan perwarnaan bakteri menggunakan metode diferensial, ditemukan bahwa pada bakteri gram positif bentuk bakterinya adalah Cocus (Bulat). Sedangkan pada gram negatif morfologi bakterinya berbentuk bacillus pendek.

BAB V

PENUTUP

A.  Simpulan

Dari hasil pengamatan praktikum ini dapat diperoleh kesimpulan yaitu :

1.        Berdasarkan perbedaan struktur selnya reaksi senyawa yang digunakan adalah pewarnaan tahan asam ( Acid Fast Stain) pewarnaan, Pewarnaan negative (Negative Staining), Pewarnaan Flagella (Flagella Stain), Pewarnaan kapsul (Capsul Stain).

2.        Pengecatan gram meliputi 4 tingkatan yaitu, pemberian cat utama, pengintensifan cat utama dengan penambahan larutan mordan, pencucian dengan alkohol dan pemberiaan cat penutup.

3.      Pewarnaan Sederhana, tujuan pengecatan ini untuk membedakan bakteri dari benda yang bukan bakteri dan ukurannya, zat pewarnaan yang digunakan hanya satu warna. Pengecatan Diferensia, yaitu pengecatan yang digunakan untuk membedakan bakteri atau mengidentifikasikan jenis – jenis bakteri yang terdapat pada media, zat yang digunakan lebih dari satu  macam zat pengecat.

B.  Saran

Keaktifan dalam praktikum sangat diperlukan serta praktikan harus memperhatikan arahan dari asisten agar praktikum dapat berjalan sesuai dengan yang diharapkan.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjosoeputro, D., 2003,  Dasar-dasar Mikrobiologi., Djambatan, Jakarta.

Irianto, Koes, 2006, Menguak Dunia Mikroorganisme, Jilid 2, Yrama Widya,         Bandung.

James, Joyce, Colin baker, Helen Swain, 2008, Prinsip – Prisip Sains untuk            Keperawatan, Erlangga, Jakarta.

Pelczar. M.J,. dan Chan, E.C.S,. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 1. UI Press: Jakarta.

Pratiwi, Sylvia T, 2008, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga Medical Series, Jakarta.