Kromatografi Lapis Tipis

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan , dan kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah : (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) (Roy, 1991).

Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda (Anggraeni, Megawati, 2009).

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama kali dijelaskan oleh Michael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa ( Sudarmadji, 2007 ). Pada saat itu, Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmen-pigmen lain dari ekstrak tanaman menggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium karbonat. Pada kromatografi, komponen- komponen yang akan dipisahkan berada diantara dua fase yaitu fase diam ( stationary ) dan fase bergerak ( mobile ). Fase diam adalah fase yang akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak adalah fase yang akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal atau tidak bergerak sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Sudarmadji, 2007).

Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama (Gandjar, 2008).

Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya menggunakan lapis tipis silica atau alumina yang seragam pada sebuah lempengan gelas atau logam atau plastic yang keras. Gel silica atau alumina mengandung substansi dimana substansi tersebut dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina (aluminum oksida). Sedangkan fase gerak kromatografi disebut juga dengan eluent. Eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Pemisahan komponen sangat dipengaruhi oleh adanya interaksi antara adsorbent dan eluen. Dalam kromatografi lapis tipis, eluen biasanya disebut sebagai larutan pengembang ( Kantasubrata, 1993 ).

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan 2 sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis. Nilai Rf dapat di jadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila di identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan bila nilai Rf nya berbeda, senyawa tersebut dapat di katakan merupakan senyawa yang berbeda (Lipsy, 2010).

1.2. Perumusan Masalah

Rumusan masalah dalam makalah ini antara lain:

·        Apa pengertian kromatografi lapis tipis?

·        Bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis?

·        Bagaimana prosedur kerja pada pemisahan sampel menggunakan kromatografi lapis tipis?

·        Apa saja fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis?

·        Apa saja kelebihan dari kromatografi lapis tipis?

·        Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam dunia farmasi?

1.3. Tujuan Penulisan

Tujuan dari penulisan makalah ini adalah agar mahasiswa dapat memahami mengenai kromatografi lapis tipis sehingga dapat mengaplikasikannya.

BAB II

PEMBAHASAN

2.1. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Atau secara sederhana kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Kromatografi di gunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponen. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip ini.

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin di deteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisika-kimia dengan fase gerak (larutan pengembang yang cocok), dan fase diam (bahan berbutir) yang diletakkan pada penyangga berupa plat gelas atau lapisan yang cocok. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) lalu hasil pengembangan di deteksi. Zat yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rf-nya paling kecil. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang.

Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relative pada pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:

      

Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf  juga disebut factor referensi.

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga R_f  adalah :

·        Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

·        Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan menge­ringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga  R_f meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,   jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap  dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.

·        Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

·        Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.

Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

·        Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.

·        Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).

·        Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terben­tuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga R_f.

·        Suhu.

Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.

·        Kesetimbangan.

Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih pen­ting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan at­mosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi  dan keadaan ini harus dicegah.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.

Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.

Gambar : Bercak yang ditimbulkan oleh sinar UV

Gambar : Sebelum dan sesudah di lakukannya kromatografi pada plat KLT

2.2. Prinsip Kerja KLT

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara  kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis  adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like”.

2.3. Prosedur Kerja Pemisahan dengan KLT

Gel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan gel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.

            Jadi, pada permukaan gel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.

Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil di gambar dekat bagian bawah fase diam dan setetes larutan campuran ditempatkan di atasnya. Garis pada fase diam berguna untuk menunjukkan posisi asli campuran.  Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fase gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.

Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.

Gambar tersebut menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Jarak yang ditempuh pelarut

Untuk identifikasinya dapat di gunakan harga R_f meskipun harga-harga R_f dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga R_f didefinisikan sebagai berikut :  

Harga-harga R_f untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga­-harga R_f yang diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daf­tar dari harga-harga R_f untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.

2.4. Fase Diam dan Fase Gerak KLT

Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.

Fase Diam

Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH.

Fase Gerak

Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen.

Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut.

Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika).

Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada:

·        Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

·        Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika.

2.5. Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut :

·        Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.

·        Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

·        Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.

·        Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa

·        Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

·        Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

·        Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)

·        Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).

·        Preparasi sample yang mudah

·        Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin

·        Kebutuhan ruangan minimum

Analisis KLT banyak digunakan karena :

·       Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek

·       Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang konstituen utama dalam sampel

·        Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel

·       Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

2.6. Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang Farmasi

            Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki.

            Setiap komponen memiliki harga R_f sendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO₄ dalam H₂SO₄ yang kemudian akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu.

            Noda kemudian dihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut sangat polar.

BAB III

PENUTUP

3.1. Kesimpulan

·        Kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.

·        Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah terjadinya hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluent maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut, sesuai dengan prinsip “like dissolve like”.

·        Pada prosedur pengerjaannya Pelarut (fase gerak) perlahan-lahan bergerak naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.

·        Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.

·        Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet, Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa, dan masih banyak lagi keuntungan lainnya.

·        Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig.

DAFTAR PUSTAKA

Anggraeni, Megawati. 2009. Kromatografi Lapis Tipis. http://greenhati.blogspot.com/2009/01/kromatografi-lapis-tipis.html. diakses tanggal 26 desember 2012 pukul 19:00 WIB.

Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar : Yogyakarta

Lipsy, P. 2010. Thin Layer Chromatography Characterization of the Active Ingredients in Excedrin and Anacin. USA: Departement of Chemistry and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology.

Kantasubrata, Julia. 1993. Warta Kimia Analitik Edisi Juli 1993. Situs Web Resmi Kimia Analitik : Pusat Penelitian Kimia LIPI

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung.

Sudarmadji, S., dkk, 2007. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta.