UJI KANDUNGAN KIMIA EKSTRAK (Penuntun Prak.Fitokimia)

UJI KANDUNGAN KIMIA EKSTRAK

1.      Tujuan percobaan

Setelah mengikuti percobaan ini diharapkan mahasiswa dapat :

-          Mengetahui prinsip dasar uji kandungan kimia ekstrak

-          Melakukan identifikasi kandungan kimia dalam suatu ekstrak bahan alam

2.      Teori singkat

Uji pendahuluan terhadap komponen kimia bahan alam bertujuan untuk mempermudah dalam pengerjaan isolasi. Uji pendahuluan dilakukan terhadap bahan alam yang baru diambil dari alam dengan menggunakan pereaksi kimia yang sesuai. Senyawa kimia yang berkhasiat sebagai obat yang terdapat dalam bahan alam.

3.      Prosedur kerja

3.1  pemeriksaan kandungan kimia alkaloid

1.      pemeriksaan kandungan kimia alkaloid menurut CULVONER dan FITZEGERALDO

kurang lebih 2-4 gram bagian tanaman segar dipotong-potong kecil, kemudian digerus bersama pasir putih, lalu di tambahkan 5 ml campuran NH₄OH dan CHCl₃, dikocok selama 15 menit, lalu disaring kedalam tabung reaksi 10ml. tambahkan 10 tetes H₂SO₄ 2 N, kemudian dikocok, lapisan air dan lapisan kloroform dipisahkan. Lapisan air di uji dengan pereaksi meyer, bila terbentuk endapan berarti positif adanya alkaloid dalam simplisia.

2.      Cara lain pemeriksaan kandungan kimia alkaloid

Pembuatan larutan percobaan :

Ekstrak yang setara dengan 20 gram bahan, panaskan diatas penangas air sampai sekental sirup, dinginkan, tambah 10 ml HCl 2 N dan panaskan lagi selama 2-3 menit. Setelah dingin tambahkan 0,5 gram NaCl untuk mengendapkan protein-proteinnya, saring kemudian filtrate ditambahkan HCl 2 N sampai 10 ml. bagi menjadi 4 bagian dan masukkan ke dalam tabung reaksi.

a.      Reaksi pengendapan

Tabung reaksi yang berisi larutan percobaan diatas ditambahkan pereaksi meyer, apabila terjadi kekeruhan atau pengendapan berarti positif terdapat alkaloid.

Selanjutnya tabung yang lain ditambah NH₄OH 28% sampai alkalis lalu ekstraksi dengan 10 ml kloroform. Fase kloroform ditambah NA₂SO₄ eksikatus kemudian saring. Filtrate diuapkan sampai kering untuk percobaan.

b.      Kromatografi Lapis Tipis

Ekstrak kloroform yang telah diperoleh, dilakukan kromatografi lapis tipis dengan eluen etil asetat : metanol : air (1000 : 65 : 135). Penampak noda digunakan pereaksi dragendorf. Apabila terbentuk noda orange, berarti positif adanya alkaloid.

c.       Menentukan adanya alkaloid (kwartener, amino oksida)

Fase air ditambah HCl 2 N sampai netral, kemudian berturut-turut ditambah pereaksi mayer dan pereaksi wagne, bila terjadi kekeruhan atau endapan maka positif adanya alkaloid.

3.2  Pemeriksaan kandungan kimia triterpen/steroid dan saponin

Uji ini dilakukan dengan menggunakan metode SIMES, dkk yaitu kira-kira 2-4 gram daun dipotong-potong kecil dan digerus bersama etanol, campuran tersebut dididihkan (dipanaskan) selama 15 menit. Lalu disaring panas, filtrate diuapkan sampai kering. Ekstrak kering ditambahkan eter, setelah terlebih dahulu disuspensikan dengan sedikit air, bagian yang dalam eter dipisahkan sedangkan abgian yang sudah larut ditambahkan lagi sedikit air, perhatikan terjadinya busa yang stabil selama 30 menit, ditambahkan reagen Libermann-Bouchardad, bila timbul warna merah atau merah jambu menunjukkan adanya triterpen atau steroid.

3.3  Pemeriksaan kandungan kimia glikosida saponin

1.      Percobaan pendahuluan

a.      Tes buih

-          Ekstrak X setara dengan 2 gram bahan di tambah 10 ml aquades, kocok kuat-kuat.

-          Perlakuan kontrol, 1 gram senegae Radix ditambah 10 ml aquadest, kocok kuat-kuat.

-          Untuk blanko, 10 ml aquades ditambah sedikit alcohol 80%, kocok reaksi positif bila terjadi buih 3 cm diatas permukaan cairan, bedakan perlakuan kontrol dan perlakuan blanko.

b.      Tes hemolisis darah

Ekstrak X setara dengan 2 gram bahan ditambah 10 ml aquadest dalam tabung reaksi, tambahkan beberapa tetes darah yang telah difebrinasikan, demikian pula pada kontrol dan blanko seperti pada A, amati secara visual dan mikroskopik.

2.   Reaksi Warna

     a. pembuatan larutan percobaan

                    Ekstrak X setara dengan 10 gram bahan diuapkan diatas penangas air sampai kering. Setelah dingin kocok dengan 10 ml Heksana/Petrolium eter, decanter filtrat dibuang. Ulangi sampai heksana/petroleum eter tidak berwarna lagi. Residu ditambah 10 mlkloroform, kocok selama 5 menit. Decanter tabung reaksi yang berisi 100 ml NA₂SO₄ anhidrat selanjutnya disaring. Filtrat dibagi 4 bagian (A,B,C).

b. Tes Libermann-Buchard (Untuk steroida tak jenuh dan triterpen)

- Filtrat A sebagai blanko

- Filtrat B ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H₂SO₄ pekat, kocok pelan-pelan lalu amati terjadinya perubahan warna, bedakan dengan blanko.

- Perubahan Warna:

   Hijau/Biru untuk saponin steroida

   Mearh/violet untuk saponin jenuh

c.Tes Filtrat Salkowski (untuk steroida tak jenuh)

- Filtrat A sebagai blanko

- Filtrat B ditambahkan 1-2 ml asam sulfat pekat melalui dinding-dinding tabung reaksi. Reaksi positif apabila terbentuk warna merah pada fase asam (air).

3. Kromatografi Lapis Tipis (untuk saponin)

   Ekstrak X setara dengan 10 gram bahan, tambah 2 ml HCl 1 N refluks diatas penangas air selama 2-6 jam untuk menghidrolisa saponin, setelah dingin  dinetralkan denagn ammonia, uapkan diatas penangas air sampai kental dan tambahkan 3 ml heksan dan kocok. Decanter ekstraksi dengan heksan 2 kali. Kumpul heksan dan uapkan, residu ditambahkan 5 tetes kloroform. Totolkan pada TLC dengan fase gerak heksan : aseton (4:1) dengan penampak noda Antimon (III) Chlorida dalam asam asetat.

Adanya saponin dapat ditunjukkan denag warna noda merah muda sampai violet.

Fase gerak yang lain yang dapat digunakan antara lain :

-          Kloroform : karbon tetraklorida : asam asetat (2:2:1)

-          Kloroform : aseton (4:1)

-          Kloroform : etil asetat (1:1)

3.4  Pemeriksaan kandungan kimia glikosida jantung

1.      Reaksi warna

a.      Tes keller keliani

Ekstrak X setara dengan 10 gram bahan diuapkan diatas penangas air sampai kering, ekstraksi berulang-ulang sampai heksan tidak berwarna. Residu diuapkan untuk menghilangkan heksannya, tamabh 3 ml FeCl₃ aduk dan masukkan dalam tabung reaksi tambah HCl pekat melalui dinding tabung reaksi, amati perubahan warna. Warna coklat kemerahan perlahan berubah menjadi violet atau biru, menunjukkan adanya gula 2-deoksi

b.      Tes libermann-Buchard

Cara pengerjaannya sama dengan cara 2.b pada uji glikosida saponin.

2.      kromatografi Lapis Tipis

Sebanyak 0,1-0,2 ml ekstrak X ditotolkan pada lempeng TLC dengan fase gerak Kloroform : metanol (4:1) dengan menggunakan penampang noda pereaksi kedde.

Positif bila terdapat noda violet pada lempeng TLC.

3.5  Pemeriksaan kandungan kimia Flavonoid (Benzopiron, Flavon, Isoflavon, Flavonol, Anthocyanin, Leucoanthocyanin, Cathecin, halcon)

1.      Pembuatan larutan percobaan

Ekstrak X setara dengan 10 gram bahan, panaskan pada penangas air sehingga kering. Ekstraksi berulang-ulang dengan petroleum eter/heksan sampai cairan tidak berwarna. Residu ditambahkan 20 ml metanol 80%, saring. Filtrat dibagi 4 (A,B,C,D)

2.      Reaksi warna (Leucoanthocyanin)

a.      Tes base smith dan Metcalf

-          Filtrat A sebagai blanko

-          Filtrat B ditambah 0,5 ml HCl pekat, amati perubahan warna dan panaskan diatas penangas air selama 15 menit dan amati perubahan warnanya. Positif bila terjadi perubahan warna merah terang atau violet.

b.      Tes wilstatter (untuk flavonoid)

-          Filtrat A sebagai blanko

-          Filtrat C ditambah 0,5 ml HCl pekat, tambahkan 3-4 potong magnesium. Amati perubahan warna yang terjadi selama 10 menit. Encerkan dengan aquadest dengan volume yang sama kemudian tambah 1 ml astil alcolhol, amati perubahan warna yang terjadi pada tiap lapisan.

Perubahan warna :

Orange merah untuk flavon

Merah sampai merah pucat (creamson) sampai merah tua (magenta) untuk flavon.

c.       Kromatografi Lapis Tipis

0,1-0,2 ml ekstrak X atau filtrat D ditotolkan pada lempeng TLC dengan fase gerak butanol : asam asetat : aquadest (4:1:5) atau asam asetat 5%. Setelah dielusi, lempeng dikeringkan. Sebagai penampak noda dipakai sinar ultraviolet dan pereaksi amoniak yang dibandingkan dengan warna noda dari rutin.

Flavonoid memberi warna :

-          Biru agak hijau

-          Merah asmpai orange

-          Kuning jelas – coklat lemah sampai hijau kuning

3.6  Pemeriksaan kandungan kimia tannin dan senyawa polifenol

1.      Pembuatan larutan percobaan

Ekstrak X setara dengan 10 gram bahan, diuapkan diatas penangas air sampai kering. Setelah dingin tambahkan 20 ml aquadest panas, kocok sampai homogen lalu tambah 5 tetes NACl 10% untuk mengendapkan zat-zat lain (kotoran). Saring, filtrat dibagi menjadi 3 bagian (A,B,C).

2.      Reaksi warna

a.      Tes gelatin

Filtrat A sebagai blanko

Filtart B ditambah larutan gelatin 1% dan NaCl 10%, amati terjadinya endapan.

b.      Tes ferri chlorida

Filtrat C ditambahkan 3 tetes larutan FeCl_3, amati warna yang terbentuk.

TABEL REAKSI WARNA UNTUK TANIN & SENYAWA POLY-FENOL

No.	Reaksi	Pengamatan	keterangan
1	FeCl3	-	Tanin (-)
2	FeCl3	Hijau biru Hijau-hitam	Tanin type catechol
3	FeCl3	Biru-hitam	Tanin type pyrogallol
4	Gelati NaCl	Tak terjadi pengendapan Tapi terjadi warna hijau-biru hitam setelah – FeCl3	Tanin (-) Polyfenol (+)

3.7  Pemeriksaan kandungan kimia anthrakinon

1.      Reaksi warna

a.      Tes borntrager

Ekstrak X setara dengan 1 gram bahan diuapkan sampai kering, setelah dingin ditambahkan 10 ml aquadest, saring, filtrate diekstraksi dengan benzene dalam corong pisah 2 kali masing-masing 5 ml. fase benzen diambil kemudian dibagi 2 (A,B).

      A sebagai blanko

      B ditambahkan 5 ml ammonia kemudian kocok

Amati perubahan warna pada lapisan alkalis, positif apabila terjadi warna merah (senyawa Anthrakinon).

b.      Modifikasi borntrager test

Ekstrak X setara dengan 1 gram bahan, uapkan diatas penangas air sampai kering. Setelah dingin ditambahkan 10 ml KOH 5 N dan 1 ml H₂SO₄ encer, panaskan diatas penangas air selama 10 menit, kemudian saring.

Filtrat ditambahkan asam asetat glasial sampai reaksi asam. Ekstraksi dengan benzen 2 kali masing-masing 5 ml. fase benzen dikumpulkan dan dibagi 2 (A,B)

-          Ekstrak A sebagai blanko

-          Ekstrak B ditambahkan 2-5 ml larutan ammonia, amati lapisan alkalis (air). Positif bila terjadi warna merah (senyawa anthrakinon)

2.      Kromatografi Lapis Tipis

0,1-0,2 ml ekstrak X ditotolkan pada lempeng TLC dengan fase gerak benzen :

Etil asetat : asam asetat (75:24:1). Penampak noda digunakan 10% KOH Metanol positif terdapat senyawa anthrakinon, apabila ditemukan barwarna :

-          Kuning-coklat kuning

-          Merah

-          Violet

-          Hijau-violet

3.8  Pemeriksaan kandungan kimia glikosida Cyanhydrin

1.      Reaksi warna

a.      Tes gurignard

2-5 gram bahan yang sudah dipotong-potong, tambahkan aquadest secukupnya dan beberapa tes kloroform serta 1 ml dari 10% larutan emulsi dimasukkan dalam tabung reaksi yang ditutup gabus dengan diselipi kertas pikrat. Kertas tidak boleh menyentuh cairan. Panaskan 34-35°C atau diamkan selama 3 jam. Apabila terjadi bayang merah, maka terdapat glikosida cyanhidrin.

3.9  Pemeriksaan kandungan kimia minyak atsiri

Kromatografi lapis tipis, 2 gram bahan diekstraksi dengan mikrodestilasi uap air. Ekstrak yang diperoleh ditotolkan pada lempeng TLC menggunakan fase gerak kloroform : benzen (1:1) dan penampak noda pereaksi asam phospomolybdat kemudian dipanaskan 1050-1100°C selama 5-10 menit.

Adanya minyak atsiri ditandai dengan munculnya noda biru.  Fase gerak lain yang dapat digunakan adalah benzen dan penampak noda yang lain adalah pereaksi vanilin, asam sulfat, pereaksi anisaldehida.

4.      Hasil Pengamatan

4.1  SAMPEL KELOMPOK

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

4.2  SAMPEL PRIBADI

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO	LABORATORIUM FITOKIMIA JURUSAN FARMASI UNIVERSITAS HALUOLEO
(6,5 X 6,5)	(6,5 X 6,5)
NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :	NAMA EKSTRAK : IDENTIFIKASI      : PEREAKSI             : KETERANGAN     :

HASIL PENGAMATAN

SAMPEL KELOMPOK

PENGUJIAN	ALKALOID			STEROID/ TRITERPENOID	SAPONIN	GLIKOSIDA SAPONIN
METODA /PEREAKSI	CULVONER/ FITZEGERALDO	MEYER	WAGNER	LIBERMANN BOUCHARD	TES BUIH	TES BUIH	HEMOLISIS DARAH	REAKSI WARNA (LIBERMANN b)
SAMPEL 1
SAMPEL 2
SAMPEL 3
SAMPEL 4
PENGUJIAN	GLIKOSIDA JANTUNG	FLAVONOID		POLIFENOL		ANTRAKINON	GLIKOSIDA CYANHIDRIN	MINYAK ATSIRI
METODA /PEREAKSI	REAKSI WARNA (LIBERMANN b)	BASE SMITH	WILSTATTER	TES GELATIN	FeCl3	BORNTRAGER	GURIGNARD
SAMPEL 1
SAMPEL 2
SAMPEL 3
SAMPEL 4

HASIL PENGAMATAN

SAMPEL PRIBADI

PENGUJIAN	ALKALOID			STEROID/ TRITERPENOID	SAPONIN	GLIKOSIDA SAPONIN
METODA /PEREAKSI	CULVONER/ FITZEGERALDO	MEYER	WAGNER	LIBERMANN BOUCHARD	TES BUIH	TES BUIH	HEMOLISIS DARAH	REAKSI WARNA (LIBERMANN b)
SAMPEL 1
SAMPEL 2
SAMPEL 3
SAMPEL 4
PENGUJIAN	GLIKOSIDA JANTUNG	FLAVONOID		POLIFENOL		ANTRAKINON	GLIKOSIDA CYANHIDRIN	MINYAK ATSIRI
METODA /PEREAKSI	REAKSI WARNA (LIBERMANN b)	BASE SMITH	WILSTATTER	TES GELATIN	FeCl3	BORNTRAGER	GURIGNARD
SAMPEL 1
SAMPEL 2
SAMPEL 3
SAMPEL 4

PEMBAHASAN PARAF ASISTEN MASUK 1 MASUK 2 MASUK 3 MASUK 4                    Assisten 1                                                                   Assisten 2     (                                              )                                     (                                         )